Istituto Nazionale di Fisica Nucleare
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ESPERIENZA DELL' UNITÀ DI BOLOGNA

Per aumentare le prestazioni della YAP Camera e consentire l'ottenimento di un numero sempre maggiore di informazioni morfologiche, farmacologiche e diagnostiche dalla raccolta delle immagini di distribuzione dell'attività, è stato possibile costruire un software di acquisizione degli impulsi molto flessibile, che da una parte consente di ottenere un conteggio semiquantitativo dell'attività e dall'altra dà la possibilità di elaborare le immagini dopo l'acquisizione in funzione dell'ottenimento di dati sulla distribuzione più utili per l'ottenimento dell'informazione farmacologia o diagnostica richiesta. Il miglior pregio di tale impostazione è quello di poter fornire informazioni "dinamiche" di distribuzione dell'attività. Infatti, è possibile separare la completa acquisizione in un numero abbastanza grande di sottoimmagini temporali (in dipendenza dall'attività iniettata) e determinare così come varia nel tempo l'attività negli organi o siti di interesse definiti dalle ROI. L'elaborazione delle immagini e delle ROI sono acquisite con programmi software commerciali quali Origin 5.0 e Scion Image.

 

ESPERIENZA DELL' UNITÀ DI LEGNARO-PADOVA

Con la YAP camera ed i software collegati si sta studiando la biodistribuzione in vivo di alcuni radiofarmaci, frutto della ricerca nel Dipartimento di Scienze Farmaceutiche, in collaborazione con i Laboratori Nazionali di Legnaro dell' INFN e la Facoltà di Veterinaria dell'Università di Padova.
La molecola di acido ialuronico è già utilizzata nella radioterapia metabolica dei tumori solidi
come veicolante di sali di acidi grassi (es. butirrato, che si è dimostrato avere proprietà chemioterapiche). Studi condotti in passato con 99mTc hanno consentito di ottenere una marcatura con rese superiori al 90% e con la YAP camera è stato evidenziato il quasi completo accumulo dell'acido ialuronico nel fegato, se iniettato per via endovenosa.

L'iniezione per via cutanea invece concentra il radiofarmaco nel sito di iniezione e solo dopo molto tempo esiste diffusione attraverso il sistema linfatico.
L'accumulo nel fegato potrebbe dare l'opportunità di assumere tale organo come bersaglio per evidenziare il danno da radiazione. Bisogna tenere presente che la percentuale di fissazione sul fegato della maggior parte dei radiofarmaci marcati con 99mTc è superiore al 70-80%. Sulla base di questi risultati, è stato elaborato un protocollo simile per la marcatura con il 188Re. Anche in questo caso, i risultati ottenuti sono molto incoraggianti.

 

ESPERIENZA DELL' UNITÀ DI ROMA3

Il laboratorio del dip. di Biologia da molti anni si occupa dell' effetto genotossico delle radiazioni a basso ed alto-LET, sia a livello di dosimetria biologica (lavori con Lloyd abr) che per quanto concerne aspetti meccanicistici nelle alterazioni della segregazione cromosomica (Sgura et al.2000, 2001) nell' ambito di programmi della Comunità Europea ("Genome Mutations", "Fission neutrons"). Inoltre, nel corso degli ultimi anni è stata consolidata una collaborazione tra il gruppo di Biologia dell' Università Roma Tre e la Fisica Interdisciplinare dei LNL-INFN che ha portato alla pubblicazione di diversi lavori su riviste internazionali nel campo della radiobiologia.
Le tecniche che vengono proposte sono riconosciute dalla comunità scientifica internazionale come strumenti particolarmente sensibili nella valutazione del danno al DNA e sono routinariamente eseguite nel nostro laboratorio.
Da topi trattati e non con il radiofarmaco (varie dosi) verranno prelevati organi di interesse per essere fissati in formalina ed analizzati. Dagli stessi topi verranno prelevate cellule del midollo osseo e splenociti per l' allestimento, la preparazione e lo scoring del danno al DNA, misurato sottoforma di induzione di micronuclei.
Questa prima fase del lavoro sperimentale consentirà di tracciare una curva dose-risposta e consentirà di verificare la presenza di genotossicità del sistema linfoproliferativo, le cui cellule sono sensibili al danno da radiazioni.
Tecniche di immunoistochimica verranno applicate su sezioni di organi dei topi trattati e sacrificati. Gli organi da analizzare saranno stati previamente selezionati sulla base dei risultati ottenuti con tecniche di imaging.
L' integrazione delle informazione ottenute dalle tecniche di imaging e dall' immunoistochimica fornirà, oltre ad indicazione sulla atttivazione di p53, informazioni utili a chiarire l' effetto "bystander" in vivo, su cui pochi sono i dati in letteratura per radiazioni convenzionali.

1. IMMUNOISTOCHIMICA: Determinazione di p53

I livelli di induzione della proteina p53 sono stati valutati con analisi immunoistochimica in organi selezionati sulla base dei risultati dell' imaging.
I topi sono sacrificati dopo il trattamento e vari organi vengono prelevati e fissati per un tempo massimo di 24 ore in formalina. Dagli organi inclusi in paraffina, vengono effetuate delle sezioni al microtomo di 5 mm di spessore che sono distese su vetrini portaoggetto, preventivamente trattate con polilisina per facilitare l' adesione della sezione. Le sezioni sono poi deparrafinate in xilene ed etanolo; viene "smascherato" l' antigene in forno a microonde (700-800 W), inibita la perossidasi interna con H2O2 ed incubati con l' anticorpo specifico di interesse (p53 policlonale di coniglio, Santa Cruz). Seguono poi passaggi atti ad aumentare il segnale ottenuto con anticorpi secondari biotinilati. Il segnale è evidenziato con una perossidasi anti-streptavidina ed i vetrini sono analizzati al microscopio ottico per la presenza e distribuzione nell'organo del segnale specifico.

2. MICRONUCLEO (Post Mortem)

La tecnica di preparazione di MN post mortem da midollo prevede il sacrificio degli animali per dislocazione cervicale. Dal femore prelevato vengono flussate le cellule di midollo in siero fetale e, dopo centrifugazione, viene eseguito lo striscio. Il vetrino è fissato in metanolo assoluto per 5 min e conservato a -20°C. Anche in questi preparati viene utilizzata la colorazione CREST per distinguere MN che originano dalla perdita di un intero cromosoma da quelli derivati da frammenti acentrici in eritrociti maturi. I primi risultati, ottenuti sugli stessi topi utilizzati per l'analisi del micronucleo di sangue periferico, confermano che la fluorescenza aumenta la sensibilità della colorazione tradizionale con il May Grunwald Giemsa; tuttavia la colorazione tradizionale con il May Grunwald Giemsa permette di identificare gli eritrociti di nuova formazione (PCE) dagli eritrociti maturi (NCE). I primi presenteranno una colorazione bluastra per la presenza di RNA mentre i secondi avranno una colorazione rossa. La colorazione CREST non permette di distinguere questi due tipi cellulari.
I nostri dati indicano che l'induzione di MN in eritrociti policromatici (PCE) e normocromatici (NCE) è più alta di quella osservata nelle cellule di sangue periferico, evidenziando o una selezione degli eritrociti micronucleati o la capacità degli eritrociti di perdere il MN dovuta a degradazione, estrusione, fusione di più MN all'interno di una stessa cellula.

L'attenzione sarà maggiormente rivolta agli effetti provocati dalle radiazioni b- emesse dal 188Re perché l'impatto con le cellule di tali radiazioni è molto più alto e dati raccolti in questo campo risultano molto interessanti sia per definire la dose di attività somministrabile al paziente riducendo al minimo effetti indesiderati che per evidenziare le differenze tra l'effetto radiante sulle cellule sane rispetto alle cellule tumorali.

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